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补肾滋肝调经汤改善高雄激素雌鼠子宫内膜容受性及胎盘功能  
 

 

 补肾滋肝调经汤改善高雄激素雌鼠

子宫内膜容受性及胎盘功能

赵小环  陈灵  张学红

兰州市第一人民医院妇产科

  目的: 研究补肾滋肝调经汤对高雄激素雌鼠子宫内膜容受性及胎盘的影响。方法:测孕4天、孕5天、孕6天子宫内膜TGF-β1表达及血清雌二醇、孕酮值,孕14天胎盘TGF-β1表达,孕5天胞饮突。结果:4天、孕5天补肾滋肝调经汤组孕酮值与模型对照组及正常对照组比较显著升高(P<0.05)。孕5天、孕6天补肾滋肝调经组子宫内膜TGF-β1较正常对照组显著升高(P <0.05) ;补肾滋肝调经汤组胎盘TGF-β1的表达与模型对照组及正常对照组比较显著降低(P<0.05)。孕5天补肾滋肝调经汤组较来曲唑组、模型对照组及正常对照组胞饮突丰富,发育良好。结论 补肾滋肝调经汤可调节高雄激素雌鼠内分泌水平,从一定程度上提高子宫内膜容受性,并有利于早期胎盘的形成。

【关键词】 补肾滋肝调经汤  子宫内膜容受性  胎盘

 

[Abstract] Objective:To study effects of BuShen ZiGan TiaoJing decoction on endomemous  receptivity and placenta.of hypsi-androgen feminity mouse. Method:

Determine TGF-β1 level of endomemous and serum estradiol and progesterone on Pregnantday 456,TGF-β1 level of placenta on pregnantday 14; Pinopde of pregnantday 5. Result: Higher progesterone level of BuShen ZiGan TiaoJing decoction group on Pregnantday 45 than model control group and normal control group (P <0.05) . Higher level of TGF-β1 in the BuShen ZiGan TiaoJing decoction group on Pregnantday 5 and Pregnantday 6 compare with normal control group(P <0.05).Higher level TGF-β1 of placenta on Pregnantday 14 in the BuShen ZiGan TiaoJing decoction group than that in

    赵小环:兰州市第一人民医院,730050,副主任医师,电话:13919331708

    陈灵:兰州市第一人民医院,主任医师

    张学红:兰州大学第一医院生殖医学研究中心,主任医师,副教授

model control group and normal control group (P<0.05). Pinopde of pregnantday 5 in the BuShen ZiGan TiaoJing decoction group was more affluence and development than         

Letrozole groupmodel control group and normal control group .Conclusion:BuShen ZiGan TiaoJing decoction adjust to endocrine secretion levels of hypsi-androgen feminity mouse; improve endomemous receptivity at some degree and benefit earlier period placenta formation.

[Key Words]  BuShen ZiGan TiaoJing decoction  endomemous receptivity  placental

 

排卵障碍约占不孕症病因的20%40% ,且病因复杂,治疗困难。包括多囊卵巢综合征,高雄激素血症,高泌乳素血症、卵巢早衰等。补肾滋肝调经汤以补肾、养血、活血为主要功效,本实验通过高雄激素雌鼠模型,观察补肾滋肝调经汤对高雄激素雌鼠子宫内膜容受性及胎盘的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级20日龄昆明小鼠(购于兰州大学实验动物中心),雌性小鼠120只,体重1012g,性成熟雄性小鼠20只,体重2530g。自由进水,维持光控时间为12:12(光亮时间为8时~20时,黑暗时间为20时~8),颗粒饲料喂养。

1.2.主要试剂及药物

1.2.1.兔抗人TGF-β1多克隆抗体(SC-146),购于北京中杉金桥生物有限公司。

1.2.2雌二醇、孕酮放射免疫试剂盒,购于北京北方生物技术研究所。

1.2.3补肾滋肝调经汤:川断30g,兔丝子、女贞子各20g,沙苑子15g,仙灵脾、巴戟天各12g,当归、枸杞各10g,购于兰州大学第一医院门诊中药房。水煎浓缩至149ml,使含生药1g/ml,通过人与小鼠药物剂量转换因子计算得出补肾滋肝调经方药组小鼠按0.2ml/10g.d灌胃。

1.2.4来曲唑片,江苏恒瑞医药股份有限公司生产,2.5mg/片,批准文号:国药准字H19991001。用生理盐水配制成2.5mg/130ml悬浊液,按人与小鼠药物剂量转换因子计算得出小鼠来曲唑组小鼠按0.2ml(0.0038mg)/10g.d灌胃。

1.3主要设备

1.3.1石蜡包埋机、切片机、光学显微镜、温孵育箱、带盖保湿盒、微波炉、冰箱、烘箱、温度计、切片架、染色缸、显微照相系统、BL-2000图像分析系统。

1.3.2智能放免测定仪,上海原子能研究所日环仪器厂,型号:SN-695B型。

1.4实验方法及标本收集

1.4.1选取20日龄昆明雌性小鼠90只按照俞瑾[1]造模方法采用丙酸睾丸酮进行造模后,随机分为3组,即补肾滋肝方药组、来曲唑组、模型对照组,每组30只,同期选择30只做为正常对照组,分别给予补肾滋肝调经汤、来曲唑悬浊液、生理盐水连续灌胃28天。

1.4.2灌胃停药24小时后行受孕实验。根据雌性小鼠阴道口外观及阴道分泌物涂片选择各组发情期小鼠,与性成熟雄性小鼠一1:11:2于下午6点合笼交配,次日晨8时观察有阴栓者为孕1天。选各组孕4天、孕5天、补肾滋肝调经组及正常对照组孕6天妊娠小鼠,摘眼球取血分离血清-20保存待测雌二醇及孕酮,同时对摘眼球处死妊娠雌鼠立即摘取一侧子宫,10%福尔马林固定行免疫组化观察TGF-β1的表达。                                                                  

1.4.3各组孕5天小鼠摘取另一侧子宫,沿纵轴剖开,2.5%戊二醛固定避光冷藏,电镜下观察胞饮突。

1.4.4各组孕14天妊娠小鼠摘眼球处死后,数出胚胎数,并随机选取一胚胎取胎盘行TGF-β1免疫组化。

1.5指标检测

1.5.1放射免疫法测血清E2P含量

将保存于-20℃待检血清样本在室温下溶解,按操作说明,用移液器取100ul血清和500ulI125在室温18-25℃温浴2h,洗涤2次加入蒸馏水2ml经智能放免g测定仪测定E2数值。同法取50ul血清和500ulI125测定P含量。

1.5.2免疫组化S-P法检测TGF-β1的表达

1.5.2.1免疫组化染色试剂盒包括TGF-β1一抗试剂盒,二抗试剂盒,DAB显色剂等。

1.5.2.2 方法 免疫组化S-P:切片厚5um,脱蜡后放入1%双氧水10min,以阻断内源性过氧化物酶。经EDTAI:50微波处理,加入TGF-β1,稀释度1150,4过夜。再加入二步法工作液,DAB显色,以PBs代替一抗作阴性对照。

1.5.2.3结果判定: TGF-β1阳性染色位于细胞浆,每张切片选择3个视野采集图像,BL-2000图像分析系统分析平均光密度(OD)值。OD值越高,表示表达越强。

1.5.3扫描电镜观察胞饮图

1.5.3.1电镜扫描步骤:将组织标本整理为3mm´3mm´2mm大小,2.5%戊二醛缓冲液中固定lh1%饿酸固定2h 0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗,梯度酒精脱水,100%乙醇脱水,入纯丙酮液中 20min,转入醋酸异戊酯中,移入样品盒,置临界点干燥仪中,封闭抽真空,用液体CO2置换醋酸异戊酯,达到临界点(31,72.8大气压)温度再升高10,液体CO2气化,开启放气阀门,排出气体,喷金干燥,扫描电镜检查。

1.6统计分析:

采用SPSS10.0版统计分析软件包。各组间采用方差分析比较,p<0.05认为有统计学差异。

 

2 结果

2.14天、孕5天、孕6天血清E2P含量比较(见表1

4天、孕5天各组妊娠小鼠血清E2值相比无显著性差异。孕4天、孕5天补肾滋肝调经汤组P值高于来曲唑组、模型对照组及正常对照组,与模型对照组及正常对照组比较P<0.05,有显著性差异。孕6天补肾滋肝调经汤与正常对照组比较血清E2P无显著性差异

 

妊娠天数

组别

n

E2(pg/ml)

P(ng/ml)

4

补肾滋肝调经组

6

12611.20±717.37

64.52±20.79

来曲唑组

6

11969.54±403.32

38.97±21.75

模型对照组

5

12219.45±326.11

24.85±8.64

正常对照组

6

12102.10±154.50

53.97±31.40

5

补肾滋肝调经组

6

11096.55±454.76

98.20±14.04②③

来曲唑组

6

13162.09±291.12

90.50±25.87

模型对照组

5

10955.98±349.24

34.95±5.43

正常对照组

6

10613.62±326.80

44.28±5.19

6

补肾滋肝调经组

5

12844.22±611.66

88.23±29.67

正常对照组

5

14095.45±224.97

76.18±35.67

1  妊娠小鼠血清E2P含量放射免疫分析结果(`xs)

注:①与孕5天来曲唑组比较P<0.05, ②与孕5天模型对照组比较P<0.05。③与孕5天正常对照组比较P<0.05

2.25天各组雌鼠子宫内膜电镜下胞饮突观察的比较  

电镜下观察孕5天胞饮突发现,补肾滋肝调经汤组较来曲唑组、模型对照组、正常对照组胞饮突丰富,发育良好。

2.3 各组妊娠小鼠TGF-β1的表达

2.3.1 4天、第5天、第6天小鼠子宫内膜TGF-β1的表达的比较(见表2)

在小鼠妊娠子宫内膜TGF-β1的表达,各组在孕4天表达,5天达到最高,孕6天下降,补肾滋肝调经组孕5天与孕4天及孕6天比较均P<0.05,有显著性差异。孕5天正常对照组与补肾滋肝调经组及来曲唑组比较均P<0.05, 差异有显著性。孕6天补肾滋肝调经组与正常对照组相比无显著性差异。

 

2    子宫内膜TGF-β1免疫组化平均光密度(OD)比较(`x±s)

妊娠天数

组别

n

TGF-β1

4

补肾滋肝调经组

6

0.271±0.117

来曲唑组

6

0.303±0.170

模型对照组

5

0.273±0.154

正常对照组

6

0.248±0.028

5

补肾滋肝调经组

6

0.256±0.162②③

来曲唑组

6

0.309±0.183

模型对照组

5

0.294±0.203

正常对照组

6

0.242±0.011

6

补肾滋肝调经组

5

0.260±0.121

正常对照组

5

0.255±0.103

①与补肾滋肝调经汤组孕5天比较P<0.05.②与补肾滋肝调经汤组孕6天比较P<0.05.③与孕5天正常对照组比较P<0.05. ④与孕5天正常对照组比较P<0.05.

 

2.3.2 14天各组小鼠胎盘TGF-β1的表达的比较(见表3

14天胎盘TGF-β1的表达的OD值,补肾滋肝调经汤组低于来曲唑、模型对照组及正常对照组,P<0.05,统计有显著性差异.

 

3    胎盘TGF-β1免疫组化平均光密度(OD)分析结果(`x±s)

组别

补肾滋肝调经组

来曲唑组

模型对照组组

正常对照组

n

6

6

5

6

TGF-β1

0.279±0.143①②

0.31±0.186

0.338±0.130

0.358±0.136

①与模型对照组比较P<0.05.②与正常对照组比较P<0.05

 

24 各组小鼠妊娠率的比较(见表4

补肾滋肝调经组与正常对照组妊娠率无统计学差异(P>0.05),但与来曲唑组及模型对照组有统计学差异(P <0.05).

 

4    各组小鼠妊娠率分析结果(`x±s)

组别

总例数

妊娠例数

妊娠率

补肾滋肝调经汤

30

25

83.33%25/30

来曲唑组

30

22

73.33%22/30)①

模型对照组

30

16

53.33%16/30)①

正常对照组

30

28

93.33%28/30

①与补肾滋肝调经汤组比较P<0.05

 

2.5 14天各组小鼠胚胎着床数的比较(见表5

补肾滋肝调经组与来曲唑组、模型对照组及正常对照组胚胎着床数比较P >0.05,无统计学差异。

 

组别

补肾滋肝调经组

来曲唑组

模型对照组组

正常对照组

n

8

10

7

11

胚胎数()

10.00±1.41

11.83±2.71

11.60±2.19

10.38±1.99

5     各组小鼠胚胎着床数分析结果(`x±s)

 

 

4.讨论

中医界普遍认为排卵功能障碍性不孕症在中医领域以肾虚血瘀为主。肾虚与血瘀关系密切,互为因果。一方面,肾的功能活动异常,必将影响血液的正常运行。另一方面,血瘀可加重肾虚。肾与肝,一藏一泻,共同协调女子生殖功能,促使卵子有规律地排出。

补肾滋肝调经汤方药的组方以肾为主体,具有补肾填精、养血活血等作用。通过补肾中精气,冲任通盛,血海充盈,作用于下丘脑-垂体-卵巢性腺轴,通过对肾轴的调节,促进了活性物质的产生和增强,使卵巢功能和子宫内膜得到平衡协调,从而促进调控早孕、着床等各环节的活性物质的增加,为早孕提供良好的条件,使妊娠顺利完成。黄亚黎[2]对补肾滋肝调经汤和克罗米芬促排卵进行了临床对比研究,表明补肾滋肝调经汤促排卵疗效肯定 ,并具有较好的治疗月经失调作用 ,其机理主要是补肾调节下丘脑腺垂体卵巢轴的功能而促排卵。

    子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力,即允许胚胎粘附其上直至植入完成的特定阶段,它受严格的时-空限制 [3]。子宫内膜接受性的建立是胚胎在子宫内定位、黏附和成功着床所必需的。子宫内膜状态的异常改变常导致接受性不能建立,是许多妇女不育的潜在原因[4]。 哺乳动物妊娠的建立依赖于胚胎的成功着床,涉及来源于子宫和胚胎的多种细胞的一系列复杂的相互作用。接受着床能力胚泡的状态,称为子宫容受性 [5]。小鼠的子宫在妊娠或假孕第13d为接受前期,4d 进入接受期,5d 下午进入非接受期。人的月经周期分为增殖期和分泌期。在分泌期,子宫在排卵后约前7d 为接受前期,在分泌中期进入接受期,约为排卵后第710d ,到分泌晚期转为非接受期 [6]

在细胞形态学方面, 众多学者认为胞饮突(pinopde) 作为评价子宫内膜容受性的指标,它是植入窗期子宫内膜上皮细胞膜顶端出现的大而平滑的膜突起。于1958Niesson [7]首次在鼠子宫标本的扫描电镜( SEM)下观察到。在正常小鼠、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor , Lif ) 基因敲除以及同源盒A10 基因(homeo box A10 , Hoxa10) 敲除小鼠的围着床期子宫中,胞饮突的形态比较相似,从妊娠第3.5d上升,一直持续到第7.5d。在卵巢切除小鼠中,胞饮突在雌激素处理组程度较弱,但在注射芝麻油的对照组中,胞饮突数目增加[8]。胞饮突的形成依赖于孕酮和雌激素, 其中孕酮受体(progesterone receptor ,PR) 在调控胞饮突形成过程中发挥重要作用。动物实验表明,NMRI小鼠超排卵,注射孕激素组的胞饮突形成充分,而未注射组大部分无胞饮突形成,孕激素可致胞饮突的提前成[9]。本实验发现,补肾滋肝调经汤组较来曲唑组、模型对照组、正常对照组孕5天胞饮突丰富,发育良好。

转化生长因子β1 (TGFβ1) 是转化生长因子家族的重要成员,参与着床前子宫内膜上皮、腺上皮和基质细胞增殖, 调节滋养层细胞的分化, 促进子宫内膜蜕膜化。在子宫蜕膜化的过程中, TGFβ1 被表达, 并与雌、孕激素一起调节细胞增殖与分化 [10]TGFβ1在早、中增殖期子宫内膜腺体或间质细胞表达较少;晚增殖期表达显着增加,且间质强于腺体;提示TGFβ1 在体内可能促进子宫内膜生长,局部发挥雌激素样作用。TGFβ1在分泌早期较少表达,而分泌中期腺体及间质细胞胞质有丰富表达,提示TGFβ1 与分泌期子宫内膜的形成有关[11]。王琳[12]研究发现.TGF - β1 在妊娠期高血压疾病组中表达明显高于正常妊娠组,证实了TGF - β1 表达异常使滋养细胞侵蚀子宫螺旋动脉过浅,滋养细胞浅植入和不正常的子宫胎盘血管抵抗,从而引发妊娠期高血压疾病。本研究显示在小鼠妊娠子宫内膜TGF-β1的表达,孕5天正常对照组与补肾滋肝调经组及来曲唑组比较均P<0.05, 差异有显著性。孕14天胎盘TGF-β1,补肾滋肝调经汤组低于来曲唑、模型对照组及正常对照组,P<0.05,统计有显著性差异,表明补肾滋肝调经汤在一定程度上提高子宫内膜的容受性,并有利于早期胎盘的形成。

甾体激素是胚泡着床的启动因素和重要的调节因子,雌、孕激素水平的失衡不利于胚泡的着床,也直接影响子宫内膜自身或其它受体的表达。低雌激素水平可使子宫窗口期时象延长,高水平则使其很快关闭,同时引起植入相关基因表达异常。雌激素水平过高或孕酮水平过低导致孕酮/雌激素失调时可降低子宫内膜的容受性,胚泡着床失败。因此,对于胚胎着床,孕酮/雌激素比值较孕酮与雌激素绝对值更重要[13]。通过本实验发现4天、孕5天各组妊娠小鼠血清E2值相比无显著性差异。孕4天、孕5天补肾滋肝调经汤组P值高于来曲唑组、模型对照组及正常对照组,孕5天补肾滋肝调经汤与模型对照组及正常对照组比较P<0.05,有显著性差异。

总之,通过此研究发现补肾滋肝调经汤在一定程度上可促进高雄激素雌鼠子宫内膜的生长,提高子宫内膜的容受性,有利于受精卵的着床,提高妊娠率。同时有利于早期胎盘的形成,提高胎盘的功能。

 

参考文献

 

[1]张月萍,俞瑾,归绥琪。雄激素致不孕大鼠发病机制及滋肾阴药对其促排卵作用.中华内分泌代谢杂志,1994.10(2):98-101.

[2]黄亚黎.补肾滋肝调经汤促排卵34例临床观察[J].四川中医,2003,7:61-62

[3]魏丽坤, 张雷 , 王蔼明.子宫内膜容受性的形态学和分子生物学相关标志[J].生殖医学杂志,2008,1 (17 ): 74-78.

[4] Makker A , Singh M M. Endometrial receptivity : clinical assessment in relation tofertility ,infertility , and antifertility.Med Res Rev ,2006 ,26 (6) : 699746.

[5] Makker A , Singh M M. Endometrial receptivity : clinical assessment in relation to fertility , infertility , and antifertility.Med Res Rev ,2006 ,26 (6) : 699746.

[6] Wang H ,Dey S K. Roadmap to embryo implantation : clues from mouse models. Nat Rev Genet ,2006 ,7 (3) : 1851991

[7] Niesson O. Ult rast ructure of mouse uterine surface epithelium under different estrogenic influences. 3. Late effect of estrogen administered to spayed animals [J] . Ultrastruct Res , 1959 , 2 (3) :342-351.

[8] Quinn C E ,Detmar J ,Casper R F. Pinopodes are present in Lif null and Hoxa10 null mice. Fertil Steril ,2007 ,88 (4 Suppl) :10211028.

[9]SalehniaM.Differentpattern ofpinopodes expression in stimulated mouse endometrium[J].ExpAnim, 2005, 54(4): 349-352.

[10] 郝晶, 高英茂, 刘凯等,转化生长因子β1及其受体在着床期小鼠子宫内膜中的免疫组织化学研究[ J ]. 解剖学报, 2001,32 (1) : 64-67.

[11Erickson GF, Fuqua L, Shimasaki S. Analysis of spatial and temporal expression patterns of bone morphogenetic protein family members in the rat uterus over the estrous cycleJ. Endocrinology, 2004,1822: 203-217.

[12王琳,孙壮状,关咏梅.娠期高血压疾病患者胎盘组织中转化生长因子-β( TGF -β1 ) 和整合素β3 ( Integrinβ3 ) 的表达[ J ]. 齐齐哈尔医学院学报, 2008,29 (5) : 526-7.

[13]HuangDM,Nardo LG,HuangGY,etal.Effect ofA Single dose of Mifepristone of Expre -ssion of Pinopodes in Endometrial Surface of Mice[J].Axta PharmacolSin, 2005, 26(2): 212-219

 

 

 

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